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本制品为Pyrococcus furiosus中分离的pfu DNA聚合酶基因在大肠杆菌中进行表达后经多步纯化分离而得。Pfu DNA聚合酶具有3'→5'外切酶(校正)活性，当聚合反应发生碱基错配时，聚合酶的校正活性可将错配的碱基切除。Pfu DNA聚合酶为使用范围最广的高保真DNA聚合酶，其错误率仅为1.3×10-6，推荐Pfu DNA聚合酶用于需高保真的PCR反应。

用于要求保真度比较高的PCR反应，包括克隆PCR、DNA片段拼接、引入突变、全基因合成，DNA片段的补平等。


在74℃条件下，30分钟内催化10nmol dNTPs的掺入反应成为酸不溶性物质所需的酶量为一个单位。

组分	250U	1250U
Pfu DNA聚合酶(5U/μL)	50μL	50μL×5
10×Pfu Buffer with Mg2+	1mL	1mL×5
dNTPs (10mM each)	200μL	200μL×5

保存：-20℃


经多次柱纯化，SDS-PAGE检测纯度大于95%，qPCR方法检测无大肠杆菌DNA残留，无核酸内、外切酶污染。

• Pfu DNA聚合酶产生的PCR产物为平滑末端，无3'端"A"突出，其PCR产物的克隆有几种方案：
  
  • PCR前引物进行5'端加磷修饰或将PCR产物磷酸化处理后再直接克隆于平末端的载体中；
    
  • 将产物3'末端加A后再与T载体连接；
    
  • 引物中引入15bp与载体同源序列，利用一步定向克隆试剂盒直接连接到目的载体。
• 由于Pfu DNA聚合酶的校对活性可引起引物从3'端被部分降解。因此在设计引物时应适当增加引物的长度，理想的引物长度为20～30bp。另外为了减少由3'→5'外切酶活性引起的引物降解，尽量在冰上配制反应体系，并最后加入Pfu DNA聚合酶。

• 2mM Mg²⁺可以满足绝大多数PCR扩增，对于某些PCR，为了保证较好的扩增，可调节为2～4mM。
  
• 体系中加入推荐的酶量，可以满足大多数PCR扩增，对于某些PCR，为了得到较好的扩增，可适当增加酶量。

图1．50μL扩增体系中，以5ng λDNA为模板，对500bp～6.0kb片段的扩增结果。
泳道1：0.5kb；泳道2：1.0kb；
泳道3：2.0kb；泳道4：3.0kb；
泳道5：4.0kb；泳道6：6.0kb；
泳道M：1kb DNA Ladder。

• 常用反应体系（50μL）：
  

  成分	用量
  10×Pfu Buffer with Mg2+	5μL
  上游引物	0.2～1.0μM（终浓度）
  下游引物	0.2～1.0μM（终浓度）
  dNTPs (10mM each)	1μL
  模板	1～50ng（质粒） 10ng～1μg（基因组）
  Pfu DNA聚合酶(5U/μl)	0.25μL (1.25U)
  ddH2O	至50μL

  注：Mg²⁺终浓度为1.5mM
  
• 常用PCR反应程序：
  
  • 当扩增片段＜3K：
    

    反应阶段	温度	时间	循环数
    预变性	94℃	90s	1
    变性	94℃	20s	30
    退火	50～60℃	20s
    延伸	72℃	1kb/60s
    终延伸	72℃	5min	1
    保温	4℃	-	1

  • 当扩增片段≥3K（推荐引物长度≥30bp）：
    

    反应阶段	温度	时间	循环数
    预变性	94℃	20s	1
    变性	94℃	5s	30
    退火/延伸	68℃	1kb/60s
    终延伸	72℃	5min	1
    保温	4℃	-	1

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